Napredne zmogljivosti Učinkovita proizvodnjaSpektrofotometer je eden izmed znanstvenih instrumentov, ki jih pogosto najdemo v številnih raziskovalnih in industrijskih laboratorijih. Spektrofotometri se uporabljajo za raziskave v laboratorijih fizike, molekularne biologije, kemije in biokemije. Običajno se ime nanaša na ultravijolično vidno (UV-Vis) spektroskopijo.
Energija svetlobe je odvisna od njene valovne dolžine, ki jo običajno imenujemo lambda. Čeprav se elektromagnetni spekter razprostira na ogromnem območju valovnih dolžin, lahko večina laboratorijev meri le majhen del teh valov. UV-Vis spektroskopija meri med 200 in 400 nanometrov (nm) za meritve UV svetlobe in do približno 750 nm v vidnem spektru.
Za UV-Vis spektroskopijo vzorci običajno vsebujejo in merijo v majhnih posodah, imenovanih kivete. Te so lahko plastične, če jih uporabljamo v vidnem spektru, vendar jih je treba uporabiti za kremenčevo ali taljenje kremena, če se uporabljajo za UV meritve. Obstaja nekaj strojev, ki lahko uporabljajo steklene epruvete.
Vidna spektroskopija se pogosto industrijsko uporablja za kolorimetrijo. S to metodo se vzorci merijo pri več valovnih dolžinah od 400 do 700 nm, njihovi profili vpojnosti pa se primerjajo s standardom. To tehniko pogosto uporabljajo proizvajalci tekstila in črnila. Drugi komercialni uporabniki UV-Vis spektroskopije vključujejo forenzične laboratorije in tiskalnike.
V bioloških in kemijskih raziskavah raztopine pogosto količinsko določimo z merjenjem njihove stopnje absorpcije svetlobe na določeni valovni dolžini. Vrednost, imenovana koeficient izumiranja, se uporablja za izračun koncentracije spojine. Na primer, laboratoriji za molekularno biologijo uporabljajo spektrofotometre za merjenje koncentracij vzorcev DNA ali RNA. Včasih imajo napreden stroj, imenovan spektrofotometer NanoDrop ™, ki porabi del količine vzorca v primerjavi s tisto, ki jo uporabljajo tradicionalni spektrofotometri.
Če je količinsko določanje veljavno, mora vzorec upoštevati zakon Beer-Lamberta. To zahteva, da je absorbanca neposredno sorazmerna z dolžino poti kivete in absorpcijo spojine. Na voljo so tabele koeficientov izumrtja za številne spojine, vendar ne za vse.
Številne kemične in encimske reakcije sčasoma spreminjajo barvo, za merjenje teh sprememb pa so zelo koristni spektrofotometri. Na primer, encimi polifenol oksidaze, ki povzročajo, da sadje rjavo oksidira raztopine fenolnih spojin, spreminja bistre raztopine v tiste, ki so vidno obarvane. Takšne reakcije je mogoče preskusiti z merjenjem povečanja absorbance, ko se barva spreminja. V idealnem primeru bo hitrost spremembe linearna in iz teh podatkov je mogoče izračunati stopnje. Naprednejši spektrofotometer bo imel držalo kivete z nadzorom temperature za izvajanje reakcij pri natančni temperaturi, idealni za encim.
Mikrobiološki in molekularni biološki laboratoriji pogosto uporabljajo spektrofotometer za merjenje rasti kultur bakterij. Poskusi kloniranja DNK se pogosto izvajajo pri bakterijah in raziskovalci morajo izmeriti stopnjo rasti kulture, da vedo, kdaj naj izvedejo določene postopke. Na spektrofotometru merijo absorbanco, ki je znana kot optična gostota (OD). Iz OD lahko povemo, ali se bakterije aktivno delijo ali začnejo odmirati.
Spektrofotometri uporabljajo svetlobni vir za osvetlitev niza valovnih dolžin skozi monokromator. Ta naprava nato oddaja ozek svetlobni pas in spektrofotometer primerja jakost svetlobe, ki prehaja skozi vzorec, s svetlobo, ki prehaja skozi referenčno spojino. Na primer, če spojino raztopimo v etanolu, bi bil referenčni etanol. Rezultat je prikazan kot stopnja absorbance razlike med njimi. To kaže na absorbanco vzorčne spojine.
Razlog za to absorbanco je v tem, da imata ultravijolična in vidna svetloba dovolj energije, da kemikalije vzbudijo večjo energijsko raven. To vzbujanje povzroči večjo valovno dolžino, kar je vidno, ko je absorbanca narisana glede na valovno dolžino. Različne molekule ali anorganske spojine absorbirajo energijo na različnih valovnih dolžinah. Tiste z največjo absorpcijo v vidnem območju je človeško oko obarvano.
Raztopine spojin so lahko bistre, vendar absorbirajo v območju UV. Takšne spojine imajo običajno dvojne vezi ali aromatične obroče. Včasih pride do enega ali več zaznavnih vrhov, ko je stopnja absorpcije prikazana glede na valovno dolžino. Če je tako, lahko to pomaga pri identifikaciji nekaterih spojin s primerjavo oblike ploskve z obliko znanih referenčnih ploskev.
Obstajata dve vrsti UV-Vis spektrofotometrskih strojev, enosmerni in dvojni. Te se razlikujejo po tem, kako merijo jakost svetlobe med referenčnim in preskusnim vzorcem. Stroji z dvojnim snopom merijo referenčno in preskusno spojino hkrati, medtem ko stroji z enim snopom merijo pred in po dodajanju preskusne spojine.